Однофотонная микроскопия
Основной принцип конфокальной микроскопии заключается в том, что свет, собранный с образца, пространственно фильтруется конфокальной апертурой, и только фотоны из одного пятна образца могут достичь детектора. По сравнению с обычной микроскопией конфокальная микроскопия имеет ряд преимуществ, таких как повышенная контрастность изображения и лучшее разрешение по глубине, поскольку точечное отверстие (pinhole) устраняет все фотоны, находящиеся не в фокусе, включая рассеянный свет.
Установка конфокального флуоресцентного микроскопа
В этой установке объектив фокусирует свет возбуждения от лазера на флуоресцентный образец и в то же время собирает результирующее излучение. Фотоны излучения проходят через конфокальную апертуру и попадают в однофотонный детектор (SPD). Для каждого обнаруженного фотона УЗИП выдает на своем выходе импульс напряжения, а именно фотонный импульс.
В конфокальной микроскопии область обнаружения представляет собой небольшое дифракционно-ограниченное пятно. Поэтому для записи изображения необходимо сканировать поверхность образца точка за точкой и регистрировать сигнал детектора в каждом месте. Большинство сканирующих микроскопов используют траекторию растрового сканирования, которая шаг за шагом и построчно посещает каждую точку образца. На рисунке ниже визуализируется путь перемещения в типичном растровом скане.
На рисунке сканирование начинается с нижнего левого угла и продолжается поэтапно по горизонтали. В каждой позиции сканирования сканер должен ждать произвольное время интегрирования, чтобы обеспечить достаточное количество фотонов. Этот процесс останавливается, когда сканер достигает верхней правой точки.
На пути сканирования позиционер генерирует импульс для каждой новой позиции образца. Для измерения конфокального флуоресцентного изображения необходимо контролировать время следующих трёх сигналов: импульсов-отсчётов одиночных фотонов, импульсов синхронизации лазера и импульсов-триггеров смещения пьезоэлектрического позиционера.
Изображение с растрового сканирования
Лазерные модули
Как правило, для возбуждения различного рода люминесценций в исследуемых образцах используются импульсные лазерные модули с короткими длительностями импульсов. |
На что обращать внимание при выборе лазерных модулей для целей однофотонной микроскопии?
В первую очередь это:
- Центральная длина волны и её стабильность
- Параметры импульсного режима (длительность импульса, частота)
- Параметры мощности импульса
- Тип вывода света
Подходящие решения
WТIG пикосекундный волоконный лазер | Фундаментальная 1064 нм, вторая гармоника 532 нм | Длительность импульса 40-60 пс | Диапазон частот: 0–1кГц | Энергия импульса: 400 нДж @532 нм | Вывод через выходной коннектор под волокно | |
|
IGL пикосекундный волоконный лазер | Фундаментальная 1064 нм, вторая гармоника 532 нм | Длительность импульса 50±5 пс @ 1064 нм | Диапазон частот 50 кГц–50 МГц | Энергия импульса: до 50 мкДж @532 нм | Вывод через выходной коннектор под волокно |
|
Импульсные лазерные диодные модули LDS | 450 - 1550 нм |
Длительность импульса
50 - 150 пс |
Диапазон частот до 30 МГц |
Пиковая мощность
50 - 1000 мВт |
Волоконный вывод |
|
532 нм лазер на микрочипе серии MH | 532 нм | 300 пс | Диапазон частот: 5-50 кГц |
Средняя мощность 25 - 50 мВт
Выходная энергия 1-5 мкДж |
Free-space |
|
266 нм лазер на микрочипе серии MB | 266 нм | 500 пс | 100 Гц |
Средняя мощность 1 мВт Выходная энергия 10 мкДж |
Free-space |
|
355 нм лазер на микрочипе серии MH | 355 нм | 300 пс |
Диапазон частот: 5/10 кГц |
Средняя мощность 10/20 мВт Выходная энергия 2 мкДж |
Free-space |
|
Сверхбыстрый волоконный лазер Rainbow 532 OEM | 515-532 нм | < 15 пс | Диапазон частот: 10-50 МГц |
Выходная мощность 5 Вт Пиковая мощность 20 кВт |
Волоконный, коллимированный |
|
Poplar-355 - Ультрафилетовый (УФ) лазер (355нм) | 355 нм | < 20 нс |
Частота следования 20-200 кГц |
Выходная мощность до 18 Вт | Free-space |
|
Лазерный диодный модуль LBX-375 HPE | 375 ± 5 нм | Нарастание/спад ≤300 нс | Частота следования CW-1 МГц | Выходная мощность до 400 мВт |
Волоконный/Free-space
|
|
Лазерный диодный модуль LBX-405 HPE | 405 ± 5 нм | Нарастание/спад ≤200 нс | Частота следования CW-1 МГц | Выходная мощность до 1.2 Вт |
Волоконный/Free-space
|
Пьезоэлектрические позиционеры
Пьезоэлектрические позиционеры необходимы в микроскопии для плавного и высокоточного перемещения исследуемого образца относительно сканирующего лазерного луча. |
На что обращать внимание при выборе позиционера?
В первую очередь это:
- Шаг перемещения
- Диапазон перемещения
- Скорость перемещения
- Параметры работы в вакууме
Подходящие решения
|
SLC-1720 - Нанопозиционер | Ширина шага: 1-1500 нм | Диапазон перемещения: ± 6 (12) мм | Скорость > 20 мм/с | Вакуум до 10-11 мбар |
|
8NTS-XYZ-200-A - Сканирующий пьезотранслятор с центральным отверстием |
Разрешение (замкнутый контур): 1 нм
Разрешение (открытый контур): 0.1 нм |
Диапазон перемещения по XY: 200 x 200 мкм
Диапазон перемещения по Z: 20 мкм |
Максимальная скорость сканирования 10 Гц | Доступная вакуумная опция |
|
8NTS-XYZ-200 - 2(3)D сканирующий пьезотранслятор |
Разрешение (замкнутый контур): 1 нм
Разрешение (открытый контур): 0.1 нм |
Диапазон перемещения по XY: 200 x 200 мкм
Диапазон перемещения по Z: 20 мкм |
Максимальная скорость сканирования 10 Гц | Доступная вакуумная опция |
|
DLS-5252 - Линейный позиционер с гибридным приводом | Разрешение: 1 нм |
Диапазон перемещения: 30 мм
Диапазон сканирования: > 35 мкм |
Скорость до 20 мм/с | Вакуум до 10-11 мбар |
|
8NTS-XYZ-40-SPM - Плоскопараллельный пьезо нанотранслятор |
Разрешение (замкнутый контур): 1 нм
Разрешение (открытый контур): 0.1 нм |
Диапазон перемещения по XY: 40 x 40 мкм
Диапазон перемещения по Z: 5 мкм |
Максимальная скорость сканирования: 50 Гц | Доступная вакуумная опция |
Оптические фильтры
Оптические фильтры часто используются в системах по изучению люминесценции в качестве компонента, выделяющего нужную спектральную полосу свечения и отсекающего различные фоновые засветки и/или ненужные для эксперимента гармоники. |
При выборе оптического фильтра необходимо обращать внимание в первую очередь на:
- Спектральный(-е) диапазон(-ы) фильтрации
- Тип крепления
- Величина поглощения и отражения в максимумах пропускания
Подходящие решения
|
Многополосный фильтр FF01-CH2O-25 серии BrightLine®, Semrock | Пропускание 11 пиков 380–480 нм (потимизирован для флоуресценции CH2O) | Прозрачность >90% в пиках | FWHM линий пропускания 4.7 нм |
|
Однополосный фильтр FF01-356/30 серии BrightLine®, Semrock | Пропускание 341-371 нм | Прозрачность >90% @ 356 нм | Гарантированная минимальная ширина полосы 30 нм |
|
Дихроичный фильтр Di01-R325-25x36 серии BrightLine®, Semrock |
Пропускание >336 нм |
Прозрачность >90% @ 336-1200 нм | Размер 25.2х35.6х1.1 мм |
|
Однополосный фильтр LD01-439/8 серии MaxDiode™, Semrock | Пропускание 435-443 нм | Прозрачность >90% @ 439 нм | Гарантированная минимальная ширина полосы 8 нм |
|
Краевой длинноволновый фильтр FF01-300/LP-25 серии BrightLine®, Semrock | Пропускание 308-420 нм | Прозрачность >85% @ 308-420 нм | Размер 25х5 мм |
Детекторы маломощного излучения
Для регистрации чрезвычайно слабоинтенсивного люминесцентного излучения используются детекторы одиночных фотонов (ДОФы) и лавинные фотоприёмники.
В основе таких детекторов лежат лавинные фотодиоды, оптимизированные для работы в режиме Гейгера (SPADы). Принцип их работы заключается в регистрации образующегося электронного лавинного пробоя из-за инициировавшего этот пробой поглощённого фотона. Детекторы одиночных фотонов бывают как на видимый диапазон (материал Si), так и на ближний ИК (материал InGaAs или сверхпроводящие нанопроволоки SNSPD). |
На что обращать внимание при выборе таких детекторов? В первую очередь это:
- Диапазон рабочих длин волн
- Квантовая эффективность
- Частота темнового счёта
- Режим работы (стробируемый/gated/синхронный или free-running/асинхронный)
- Тип детектора (компонент или модуль)
- Частотная полоса
- Тип оптического ввода (волоконный или free-space)
- Возможность регулирования квантовой эффективности и/или частоты темнового счёта
- Частота стробирования (при наличии данной функции)
Подходящие решения
Полупроводниковый лавинный детектор одиночных фотонов QButterfly |
Диапазон длин волн: 900-1600 нм |
Квантовая эффективность: 20% |
Частота темнового отсчета: ≤ 2 КГц |
SPAD с ТЕС (Mini Flat type) | Диапазон длин волн 1100-1600 нм |
Квантовая эффективность до 70% |
500/2000 Гц |
SPAD с TEC (6 pin TO-8) | Диапазон длин волн 1100-1600 нм |
Квантовая эффективность до 70% |
500/2000 Гц |
SPAD без TEC (6 pin TO-46) |
Диапазон длин волн 1100-1600 нм |
Квантовая эффективность до 70% |
2 кГц |
Детектор фотонов IDQube |
Диапазон длин волн 900-1700 нм |
Квантовая эффективность до 25% |
Частота темнового счёта от 800 Гц |
SNSPD детектор ID281 |
Диапазон длин волн 400-2500 нм |
Квантовая эффективность до 90% | Частота темнового счёта < 1 Гц |
Детектор фотонов ID120 |
Диапазон длин волн 350-1000 нм |
Квантовая эффективность до 80% |
Частота темнового счёта < 200 Гц |
Лавинный фотоприёмник VIS |
Диапазон длин волн 400-1000 нм |
Полоса 1-1600 МГц | Уровень шума в темноте -80 дБм |
Лавинный фотоприёмник ИК | Диапазон длин волн 950-1650 нм |
Полоса 1-1800 МГц |
Уровень шума в темноте -80 дБм |
TCSPC электроника
После детектирования с электрических выходов фотоприёмников сигналы поступают на специальную синхронизирующую платформу, выполняющую сбор и предварительную обработку данных, а также синхронизацию с лазерными модулями. |
При выборе платформы для TCSPC необходимо обращать внимание на:
- Количество входных каналов
- Джиттер
- Частоту счёта и обработки
- Мёртвое время
Также немаловажно будет обратить внимание на:
- Тип логики устройства
- Скорость передачи сигнала на ПК
- Величину вносимой задержки
Подходящие решения
Серия Time Tagger